在講解精準定量的計算之前，我們需要了解一下分光光度法的原理，由于Oligo中的堿基之間存在共軛雙鍵，共軛雙鍵對光具有強吸收的特點，因此當測量吸收光譜時，在波長260 nm或接近260 nm處都有一個吸光度（Absorbance, A260），如下圖所示：
但是，我們在引物管上通常見到的是OD值，什么是OD???？
OD???是指在260 nm波長處的光密度（Optical Density, OD），OD260測量單位定義為使用1cm的光程（pathlength）、測量260 nm波長處、1 ml寡核苷酸溶液產生讀數為1.0時所需要的寡核苷酸濃度。OD???值與A???值相關，計算公式為：
OD??? = A??? x 體積(ml) /光程(cm)
由于OD260測量時體積為1 ml，光程為1 cm，所以OD???值= A???值。
1. 常見定量誤區
DNA定量和RNA定量一般稱為核酸定量，通常測量樣品中DNA或RNA的平均濃度，然后再進行下游實驗。通常，在260 nm處的吸光度即可用于測量溶液中存在的核酸的濃度。近似的轉換系數為:
a. 雙鏈DNA（ds DNA）約為50 μg/OD260；
b. 單鏈DNA（ss DNA）約為33 μg/OD260；
c. 單鏈RNA約為40 μg/OD260
當OD=1時，依據：
摩爾數(μmol)=質量/分子量=（轉換系數x OD）/分子量（MW）
代入濃度計算公式：
摩爾濃度(μmol/L,μM) =（摩爾數/體積）x 1000
*分子量（MW）的計算方式見文章最后部分
值得注意的是，轉換系數計算公式只適用于長的、堿基隨機排列的序列，對于長度較短的序列，重復序列，以及帶有特殊修飾基團的Oligo序列，每個堿基的組成、排列順序和修飾都會影響序列計算，導致定量準確率較低。
2. 什么是Oligo精準定量？
對于Oligo的定量，為了保證得到準確的定量結果，通常不能直接使用儀器測定的ng/μl數值，尤其對于帶有修飾的Oligo探針, 直接使用儀器測定的ng/μl數值會使定量結果出現很大的偏差。這時就需要引入對于寡核苷酸的定量計算至關重要的數值：消光系數（Extinction coefficient，ε）。
消光系數和最大吸收波長都會隨著共軛雙鍵數量的增加而增加，每個堿基的吸光度不同，堿基的組成和排列順序都會影響吸光度，因此在定量過程中引入了消光系數進行計算。消光系數依賴于精確的核苷酸組成和排列順序，對于每個寡核苷酸來說消光系數是唯一的，因此，通過計算每個寡核苷酸的消光系數精確值，可以獲得最高的定量準確度。
3. 如何計算Oligo的消光系數（ε）？
百力格使用鄰近法（Nearest neighbor method）計算每個合成的寡核苷酸的消光系數，然后用來計算每個寡核苷酸的產量。計算公式為：
其中：ε260：寡核苷酸序列在 260 nm 處的消光系數，單位為（L/mol·cm）；
Σ1N-1εNearest Neighbor：相鄰堿基對的消光系數之和；
Σ2N-1εIndividual Bases：單個堿基的消光系數之和；
Σ1NεModifications：修飾的消光系數之和。
參考鄰近值：
5'/3' position | Adenine | Guanine | Cytosine | Thymine | Uracil |
Adenine | 27,400 | 25,000 | 21,200 | 22,800 | 24,600 |
Guanine | 25,200 | 21,600 | 17,600 | 20,000 | 20,000 |
Cytosine | 21,200 | 18,000 | 14,600 | 15,200 | 17,200 |
Thymine | 23,400 | 19,000 | 16,200 | 16,800 | N/A |
Uracil | 24,000 | 21,200 | 16,200 | N/A | 19,600 |
單個堿基值：
Adenine | Guanine | Cytosine | Thymine | Uracil |
15,400 | 11,500 | 7,400 | 8,700 | 9,900 |
*即使鄰近法相對準確，但是其結果也可能與真值存在偏差。
4. 如何通過消光系數（ε）計算Oligo的濃度？
根據朗伯比爾定律（Beer-Lambert Law）：
A??? = ε??? × C × p （1）
推導出：
C = A??? /（ε??? × p） （2）
其中：c：Oligo濃度（mol/L）；A：吸光度；ε：消光系數（L/mol·cm）； p：光程（cm）
當光程p=1 cm，進行單位換算后，
可得百力格濃度計算公式：
C = A??? × (1/ε???) × 106= A??? × nmol/OD
其中：c：Oligo濃度（μmol/L，μM）；A：吸光度；nmol：物質的量單位；OD：光密度
5. 如何計算Oligo的分子量（MW）？
引物合成單上出現的另一個重要數據是分子量，MW用來將OD260單位轉化為質量單位，
寡核苷酸的總分子量即所有堿基的原子量之和，再根據不同類型進行調整：
a. 無5’單磷酸鹽的DNA序列：ssDNA-61.96 Da，dsDNA-123.38 Da；
b. 含5’單磷酸鹽的DNA序列：ssDNA+17.04 Da，dsDNA+34.08 Da；
c. 含5’三磷酸鹽的RNA序列：RNA+ 159.0 Da；
單位為道爾頓（Dalton，Da），1 Da ≈ 1 g/mol
Nucleotide | ss DNA | ds DNA | RNA |
Adenine | 313.21 Da | 616.78 Da | 329.21 Da |
Guanine | 329.21 Da | 617.88 Da | 345.21 Da |
Cytosine | 289.18 Da | 617.88 Da | 305.18 Da |
Thymine | 304.20 Da | 616.78 Da | N/A |
Uracil | N/A | N/A | 306.20 Da |
舉個例子來看一下依據經驗值的模糊濃度計算和百力格精確濃度計算之間的差別：
如ss DNA寡核苷酸序列5’-ATGGCTAC-3’
常規計算：
分子量MW=313.21x2+304.20x2+329.21x2+289.18x2-61.96=2409.64 Da≈2409.64 g/mol
摩爾濃度(μmol/L,μM)=（轉換系數/分子量（MW））×1000
摩爾濃度(μmol/L,μM)=（33/2409.64）× 1000≈13.69 μM
百力格計算：
消光系數計算ε260=77,600 L/mol·cm
C (μmol/L，μM)= A260×(1/ε260)×106=A260×nmol/OD=A260 ×106/77,600≈12.89 μM
*1 μM=1 μmol/L=1 pmol/μl
百力格Oligo合成
相較于儀器測定的ng/μl數值，百力格的濃度計算方式更為準確，尤其是對于長度較短的或者帶有特殊修飾基團的Oligo序列，更加貼近于真值。
百力格生物依托專業的技術人員、自動分裝設備和成熟的合成純化工藝，盡可能減少操作過程中的損失，確保Oligo精準和系統性定量
參考文獻：
[1]https://sg.idtdna.com/pages/education/decoded/article/oligo-quantification-getting-it-right
[4]Cavaluzzi MJ, Borer PN. (2004) Revised UV extinction coefficients for nucleoside–5‘–mono?phosphates and unpaired DNA and RNA. Nucleic Acids Res, 32(1) e13.
[5]Cantor CR, Warshaw MM, Shipiro H. (1970) Oligonucleotide interactions. III. Circular dichroism studies of the conformation of deoxyoligonucleolides. Biopolymers, 9(9):1059?1077.
