探針設計的關鍵在于熒光基團與淬滅基團的選擇:
a. 根據熒光定量PCR儀選擇適配的熒光基團;
b. 根據熒光基團的種類選擇合適的淬滅基團進行搭配。
Taqman探針包括四種可選擇的淬滅基團:BHQ系列、MGB、TAMRA和Eclipse。
BHQ系列
BHQ系列包括BHQ-0(430-520 nm)、BHQ-1(480-580 nm)、BHQ-2(550-650 nm)、BHQ-3(620-730 nm),組合起來的四種BHQ染料吸收光譜覆蓋430 nm-近紅外,熒光波長落在此范圍內的所有報告基團都可以被淬滅,適用于多重qPCR。
BHQ淬滅劑就像一個黑洞,本身不產生熒光,并且能夠將一定范圍內報告基團發出的熒光信號全部吸收,解決qPCR實驗體系中光污染的問題,通過降低本底信號提高熒光信號的信噪比。

MGB探針
MGB探針是雙標記探針,在TaqMan探針的基礎進行優化改進,其中3’端包含一個能夠插入DNA小溝的結合物(Minor Groove Binder,MGB),可以增加探針的熔解溫度(?提高10℃左右)并穩定探針與靶標的復合物。因此,TaqMan MGB探針明顯短于傳統探針,并且具有更好的檢測特異性。
MGB連接一個不發光的熒光淬滅基團(Non-Fluorescent Quencher, NFQ),通過NFQ基團淬滅另一端熒光報告基團所產生的信號,避免傳統淬滅基團產生的背景,熒光本底信號更低,檢測靈敏度更好。

TAMRA探針
TAMRA是一種可以用作雙標探針及分子信標的3’端和內部淬滅基團(TAMRA-dT)的熒光染料。TAMRA為熒光染料,因為它的熒光特性使淬滅基團和報告基團光譜發生重疊,從而增加背景信號干擾,并且TAMRA探針通常更長(30-40 nt),不推薦在多重qPCR過程中使用。

Eclipse探針
Eclipse為暗淬滅劑,非熒光染料,其本身不產生熒光,與TAMRA探針相比,本底信號更低,并且Eclipse具有較寬的吸光范圍,適用于多重qPCR反應。





